由于致力于在国际上宣传抗日救亡，致力于积极推进国难教育唤起民众，刘湛恩早在1937年11月间就预闻日本当局已把他列入黑名单。他在给朋友的回信中说道：我国同胞苦难深重，但我们坚决不向武力屈服。1938年初，刘湛恩拒绝“日伪教育部长”的邀请，将个人安危置之度外，坚持留在上海组织抗日活动。此后，刘湛恩就经常接到恐吓信，恫吓电话，要他放弃抗日反伪立场。同时在刘寓所周围也不时发现形迹可疑的人。种种迹象表明危险已悄悄来临。
南京西路安乐坊81号，1938年从战火中的沪江迁出暂居的刘湛恩寓所
他曾特地去看望过挚友邹韬奋，劝他“稳健一些”要防备敌人的暗算，但自己则表示要坚守岗位，不向黑暗势力低头，愿意为国际正义和永久和平付出代价。他对夫人王立明说：“我生平教导学生应为祖国献身，自己就应当以身作则，做出榜样。”
当时的上海腥风血雨，刀光剑影。汉奸、暴徒横行无忌，暗杀、绑架事件层出不穷，进步人士失踪事件时常发生，形势愈来愈险恶。早成为日本特务机关“眼中钉”的刘湛恩为坚守自己的救国理想，决不临危退离。1938年4月7日早晨8时半，刘湛恩由安乐坊寓所赴圆明园路学校，在公共汽车站候车时，突遭日伪政权收买的暴徒用达姆弹近距离刺杀，当即牺牲，以身殉国，年仅43岁。
刘湛恩遇害处示意图（X标识为凶手逃窜路线）
爱文义路及大华路交界之处,凶手即从此逃走,后被巡捕捉拿
刘湛恩是抗战时期最早被日伪杀害的文化界著名人士，他的遇害使中外人士大为震惊。当天各晚报和次日各大报刊都以醒目标题，报道刘湛恩遇害消息，强烈谴责汉奸特务的卑劣行为，高度赞扬刘湛恩平生热心国事，嫉恶“妖魔鬼怪”，“宁死不愿在他们面前屈膝”的伟大爱国主义精神，指出他的被害，“于教育及社会事业前途，殊为重大损失”；中华全国基督教协进会发表悼文，赞扬他思想丰富，生平勇敢果决，“爱国情绪热烈”，是个“忠实诚挚之君子”；国民政府联合发布的褒扬及公葬令，称刘湛恩“尽瘁教育，历有岁年，为国储材，成效盛著”；刘湛恩的挚友陶行知、邹韬奋等先后发表悼念专文，崇敬他至死不受伪命的可敬精神和伟大人格，是“中华民族的好男儿，值得我们最高的崇敬”。
刘湛恩遇害后各种报刊的报道
刘湛恩遇害后各种报刊的报道
1938年4月9日，上海各界在国际礼拜堂为刘湛恩举行入殓仪式。灵堂中间挂着“为国牺牲”挽幛，左右挂着“长校十年，苦辛备历”，“成仁一旦，中外同悲”挽联。遗体安葬在虹桥公墓。颜惠庆等知名人士和各校代表、沪江师生及家属3000余人执绋送殡。长长的队伍，成为一次规模较大的抗议日伪暴行的示威活动。
刘公湛恩之墓(上海虹桥路工部局公墓)
身死不曾忘正义 国殇何必尽疆场
——刘湛恩丧礼上的挽联
除上海外，武汉、重庆都召开了追悼会，国民政府行政院院长孔祥熙明令国葬刘湛恩。麦但尼博士在刘湛恩举殡时致悼词言：“几年后，当一个新兴的、可贵的中华从黑暗与祸患中跃升起来的时候，并知道了我们烈士的精神所贡献于新生的可贵的国家者，人们将会永远怀念他。”
1948年刘湛恩校长殉难10周年纪念册
1984年，上海市民政局追认刘湛恩为革命烈士；1985年，中华人民共和国民政部追认刘湛恩为革命烈士。
中华人民共和国民政部1985年为刘湛恩颁发的革命烈士证明书
上海市人民政府1984年为刘湛恩颁发的革命烈士证明收据
经党中央、国务院批准，中华人民共和国民政部、退役军人事务部先后于2014年9月1日、2015年8月24日和2020年9月3日公布了在抗日战争中顽强奋战、为国捐躯的1085名著名抗日英烈和英雄群体名录。他们是抗日民族统一战线的各个方面，包含了中国共产党领导下的八路军、新四军、华南游击队、东北抗日联军和其他人民抗日武装，国民党抗日将士，民主爱国人士和援华国际友人等不同群体的代表。刘湛恩位于第二批，也是英烈名录中唯一一位大学校长。
